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피날레는 2018년 8월 31일에 열렸으며 생방송으로 방송되었습니다. 이승기는 걸그룹 명사 `이즈*원`(한글: 아이즈)을 발표했다. 세포를 5분 동안 얼음 상에 배양하고 원심분리하고, 차가운 PBS 완충재로 재중단하였다. 수집된 세포를 37°C에서 30분 동안 150 mM KCl, 20 μM nigericin 및 50 mM 버퍼링 제를 함유하는 용액으로 30분 동안 배양하였다(pHs ≤ 5.5, 나트륨 아세테이트; pHs 6 내지 6.5, 모르폴린-에탄-설포닉산, pHs 7 내지 8, 인산염). 410 및 470 nm에서 여기하에서 방출된 pHluorin 형광의 비율(R410/470 값)을 세포내 pH를 측정하는데 사용되었다. Johnson, A. O. 외. 미생물 세포 공장의 대사 공학을 위한 유전자 부호인말린-CoA 바이오센서의 설계 및 적용. 메타탭. 영어 44, 253-264 (2017).

아래 표에서 파란색 숫자는 가장 낮은 등급을 나타내고 빨간색 숫자는 가장 높은 등급을 나타냅니다. 프로테아제 기반의 번역 후 조절은 신속한 반응, 합성성 및 모듈성28,39에 많은 이점을 제공하지만 단백질 회로를 구성할 때 몇 가지 제한 사항도 고려해야 합니다. 첫 번째는 프로테오리시스와 관련된 ATP 비용입니다. 단백질 기판의 전개 및 전좌가 활발히 불리하기 때문에, ClpP 매개 프로테오리시스의 총 ATP 비용은 상대적으로 높을 수 있다. 예를 들어, 약 600개의 ATP가 모델 기판 티티I27 domain40의 분해에서 소비될 것이다. 제어 가능한 단백질 분해를 도입하여 발생하는 이러한 에너지 부담은 세포 증식 및 유전 회로 출력모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 단백질 회로의 설계 및 구현에서 인공 회로의 출력 강도를 미세 조정하여 세포내 자원 점유율을 감소시키는 데 필요하다39. 두 번째 제한사항은 큐잉 효과입니다. 여러 단백질이 분해되고 단백질 분해 자원을 위해 경쟁하도록 설계되면 ClpP 기계류가 과부하됩니다.

그 결과, 예기치 않은 큐링 커플링 반응이 발생할 수 있으며, 이는 표적 단백질 분해 속도를 감소시키고, 유전 적 부분의 타고난 파라미터에 영향을 미치고, 이어서 회로 output41의 프로파일을 변화시킬 것이다. 대기열 효과를 극복하기 위한 한 가지 유망한 전략은 메소플라즈마 플로럼 론 프로테아제 복합체와 같은 이종성 프로테오리시스 기계를 이용하는 것이다12. SHK 생산을 위해, 대장균 MG165542는 섀시 스트레인 S4 시공에 사용되었다. 유전자 aroL은 프로모터 J23119 및 RBS B0034의 제어 하에 tktA 발현 카세트로 게놈으로 대체되었다. PTS 시스템(ptsH, ptsI 및 crr, HPr, EI 및 EIIAGlc을 인코딩)은 Z. mobilis로부터 포도당 촉진제 단백질 유전자인 Zmglf로 게놈으로 대체되었다. 대장균 균주 B001343, ATCC 873944, W311045, HB101, BL21, JM109 및 DH5α는 동일한 작업으로 pbDRC의 보편적 검증을 위해 사용되었다. pbDRC의 게놈 수준 조절을 테스트하기 위해, aroK의 N 종단은 TEVp 사이트(절단 부위: ENLYFQ)와 F-데그론(FLFVQ)으로 태그하였다. 이러한 변형된 aroK는 섀시 S4에서 프로모터 rpsT P2의 제어 하에 야생형 aroK의 장소에 게놈으로 삽입되었다.

아로그브르, tktA, aroBopt 및 aroE를 포함하는 통로 효소는 효소 과발현 플라스미드 pGABE를 생성하기 위해 선택되었다. 백본 플라스미드는 pMB1 복제 기원을 가진 구성적인 발현 플라스미드 pJ01(GenBank 수탁 MK234843)이었다. 유전자 aroGfbr, D146N을 관련시키는 피드백 저항하는 돌연변이는, 급속한 PCR 사이트 지시돌연변이생성에 의해 수득되었다46. 코돈에 최적화된 변이체인 아로브옵트 유전자는 처음 8개의 코돈(ATG GAG CGT ATT GTT GTT ACT CTG)의 최적화에 의해 수득되었다.47. 개선된 용해도 및 자동 용해 비활성화 TEVp 돌연변이체(T17S, L56V, N68D, I77V, S135G, S219V)48은 낮은 카피 수의 플라스미드, pTet-1(GenBank accession MK234448)에 대한 SP의 제어하에 코돈 최적화 및 표현하였다. aroK의 N 종단은 TeVp 사이트뒤에 F-데그론으로 태그가 지정되었습니다. 이러한 변형된 aroK는 PrrnB P1, PrpsT P2 및 PrpsJ를 포함하는 GPP의 제어 하에 경로 효소 과발현 플라스미드 pGABE내로 삽입되었다.

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